产品目录

本试剂盒可以培养细胞的衰老检测，也可以用于组织切片的衰老检测。产品性能稳定，参数经优化，着色敏感，特异性高。仅对衰老细胞进行染色，不会染色衰老前的细胞(presenescent cells)、静止期细胞(quiescent cells)、永生细胞(immortal cells)或肿瘤细胞。

• 不可逆的生长停滞；
  
• 与衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的活化。作为溶酶体内的水解酶，通常在pH4.0的条件下表现活性，但是衰老细胞内其在pH6.0的条件下表现活性，且随着传代次数的增加，细胞群体中表现衰老相关的β-半乳糖苷酶的细胞数目逐渐增加。

• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本试剂盒β-半乳糖苷酶染色固定液存在一定的腐蚀性和毒性，操作时请注意小心防护。
  
• 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色反应依赖于特定的pH值，不能用于细胞培养的CO₂培养箱中进行染色反应。因为CO₂培养箱中较高浓度的CO₂会影响染色工作液的pH值，导致染色失败。
  
• 40754-B刚溶解后会观察到有沉淀，属正常现象，充分混匀或者漩涡震荡可促使沉淀全部溶解，之后才能用于染色实验。配制染色工作液时，也可能有少量絮状沉淀出现，震荡混匀后就会完全溶解。在染色前一定要确保所有的试剂处于完全溶解状态。
  
• X-Gal溶液需要避光保存。染色工作液也需要避免光照。染色后的细胞样品可以在4℃冰箱保存，但也需避免光照。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 实验前的准备工作：
  
  • 染色工作液配制：
    实验开始前，将试剂盒内各组分从冰箱内取出，彻底溶解。其中X-Gal溶液最好置入冰槽里等待溶化。根据表1进行染色工作液的配制，实验体系类型，检测样本数，统一配制单次实验需要的染色工作液总量。
    表1．染色工作液配方表
    

    成分	用量
    β-半乳糖苷酶染色液A	10μL
    β-半乳糖苷酶染色液B	10μL
    β-半乳糖苷酶染色液C	930μL
    X-Gal溶液	50μL

    
    注：配制染色工作液时需使用聚丙烯(polypropylene)容器或玻璃容器，不宜使用聚苯乙烯(polystyrene)容器，对于二者的判定：聚丙烯容器可高压灭菌，而聚苯乙烯容器则不可高压灭菌，一旦高温高压处理就会严重变形。但是染色过程可以在聚苯乙烯容器内进行，如细胞培养常用的6孔板。
• 6孔细胞培养板染色(贴壁细胞)：
  
  • 吸除细胞培养液，用PBS/HBSS洗涤细胞1次，加入1mLβ-半乳糖苷酶染色固定液。室温固定15min。
    注：对于其它类型的培养板，固定液及后续溶液的用量参照此比例进行操作。
    
  • 吸除固定液，用PBS/HBSS洗涤细胞3次，每次3min。
    
  • 吸除PBS/HBSS，每孔加入1mL预热的染色工作液，覆盖整个生长表面。
    
  • 37℃孵育过夜，可以用封口膜或保鲜膜封住6孔板防止液体蒸发。
    注：37℃孵育不能在CO₂培养箱中进行，因其内高浓度的CO₂会影响染色工作液的pH值，导致染色失败。
    
  • 5、普通光学显微镜下观察和计数：表达SA β-gal的细胞为阳性细胞，呈现蓝色。如不能及时观察计数，可以去除染色工作液，加入2mL PBS缓冲液，4℃可以保存数天，或者加入封片剂封片后，4℃可保存较长时间。
• 悬浮细胞染色：
  
  • 离心收集细胞至1.5mL离心管内，用PBS/HBSS洗涤1次，加入1mLβ-半乳糖苷酶染色固定液。室温固定15min。固定时可以在摇床上缓慢摇动，以避免细胞结成团块。
    
  • 离心，吸除细胞固定液，用PBS/HBSS洗涤细胞3次，每次3min。
    
  • 离心，吸除PBS/HBSS，每管加入0.5～1mL预热的染色工作液。染色工作液的配制方法参见表1。
    
  • 37℃孵育过夜。
    注：37℃孵育不能在CO₂培养箱中进行，因其内高浓度的CO₂会影响染色工作液的pH值，导致染色失败。
    
  • 5、取部分染色好的细胞，滴加到载玻片上或6孔板内，普通光学显微镜下观察和计数。如不能及时观察计数，可以离心，去除染色工作液，加入1mL PBS缓冲液，4℃可以保存数天。也可取细胞用于涂片，加上封片剂封片后，4℃可保存较长时间。
• 冰冻切片染色：
  
  • 冰冻切片先进行复温，用PBS浸泡洗涤组织3次，每次不少于5分钟。
    
  • 加入适当体积的β-半乳糖苷酶染色固定液，以充分盖住组织为宜，室温固定不少于15min。
    
  • 用PBS浸泡洗涤组织3次，每次不少于5min。
    
  • 吸除PBS，加入适当量的预热的染色工作液。染色工作液的配制方法参见表1。
    
  • 37℃孵育过夜，可以用封口膜或保鲜膜封住防止蒸发，最好把整个切片浸泡在染色工作液中。
    注：37℃孵育不能在CO₂培养箱中进行，因其内高浓度的CO₂会影响染色工作液的pH值，导致染色失败。
    
  • 普通光学显微镜下观察和计数。如不能及时观察计数，加上封片剂封片后4℃可保存较长时间。